El metotrexato tiene su origen a mediados de los años 1940, cuando en el Hospital Infantil de Boston se estudiaba el efecto del ácido fólico en la leucemia aguda infantil.
 

Farber le pidió al doctor Yellapragada Subbarao, que creara un anti-folato, una molécula capaz de inhibir una enzima implicada en la síntesis del ácido fólico. El metotrexato fue administrado a un grupo de niños enfermos de leucemia, comprobándose su efecto beneficioso, por lo que se considera que este fármaco marcó el comienzo de la quimioterapia en el tratamiento oncológico.